Ingeniería de proteínas (2018-2019)
PETasa de Ideonella sakaiensis
13. Suponga que se está planteando rediseñar la proteína asignada, reemplazando la fenilalanina (F) a la que se refiere el apartado 8 por una Y (tirosina). Denominaremos a esta proteína mutante mut01. Evalúe las distorsiones estéricas que tal cambio podría ocasionar en el entorno inmediato de la posición afectada y elabore un breve informe con las conclusiones obtenidas. Para ello calcule las coordenadas del nuevo átomo de oxígeno, e inclúyalas en el fichero PDB (¡haga una copia primero y renómbrela como mut01!). Visualice de nuevo el entorno del residuo modificado con ayuda del script desarrollado en el apartado 7 y grábelo como imagen GIF en una orientación equivalente. Imprima ahora la imagen e inclúyala en el cuaderno de actividades junto con una breve exposición de las conclusiones obtenidas.
El objetivo principal de esta actividad es producir una mutación en nuestra proteína (PETasa), de manera que cambiemos el primer residuo de fenilalanina por una tirosina. Además veremos la potencia de esta herramienta predictiva
Para realizar dicha mutación es necesario conocer la estructura de ambos aminoácidos (Figura 1). Así, se observa que, a nivel de proteína y fichero pdb, solo tenemos que añadir las coordenadas de un nuevo grupo OH en posición para del anillo aromático de la fenilalanina, a una distancia característica de las tirosinas y con un enlace que continue la dirección del enlace simple que une al anillo (azul).
De esta forma, primero podemos determinar la distancia entre el grupo OH, que debemos añadir, y el carbono al que se une (Cz) calculando la distancia media que hay entre estos elementos en otras tirosinas de nuestra proteína. Una vez que tengamos esta información (1,3939 Å para nuestro caso), solo necesitamos un vector unitario que nos marque la dirección y sentido en la que debemos desplazarnos desde el Cz de la fenilalanina para colocar el grupo OH, convirtiéndola en tirosina. Esto se puede hacer ya que, entre las propiedades del grupo fenilo, se encuentra la rigidez y la planaridad. Como consecuencia, podemos calcular el vector que necesitamos mediante el vector diferencia entre el Cz y el CG (carbono del grupo fenilo que lo conecta al resto de la molécula) de la fenilalanina.
De esta manera, la posición del OH (vector de posición del oxígeno) estará determinada por la suma del vector de posición del Cz y el vector cuyo sentido y dirección es la del vector unitario calculado y módulo es la distancia media entre Cz y OH en las tirosinas (Figura 2).
El programa desarrollado en Lázarus/Pascal para llevar a cabo la mutación se denomina mutacion.exe y permite transformar la primera fenilalanina de una proteína en formato .pdb por una tirosina, añadiendo un átomo de oxígeno. Así, en primer lugar hay que cargar la proteína que queremos mutar en formato pdb, determinar qué Phe queremos transformar a Tyr y por último darle al botón de mutación, que permite calcular la posición en el espacio que tomará el nuevo átomo y en segundo lugar, modificar la estructura TproteinPDB y escribir un nuevo archivo .pdb que contenga el oxígeno y la Phe pase a ser una Tyr.
Así, obtendremos un nuevo archivo en formato pdb que contiene el nuevo aminoácido, sustituyendo a la Phe seleccionada, que en el siguiente ejemplo se muta la Phe50 a Tyr50 (figura 3). La interfaz gráfica del programa para esta condición sería la que se muestra en la figura 4.
Por último, realizamos una representación de la proteína silvestre y la mutada para comprobar que el cambio se ha producido adecuadamente, así como, poder visualizar posibles impedimentos o modificaciones estéricas y geométricas de la proteína. Además usaremos una serie de comandos en PyMOL parecidos a los de la actividad 8. Los resultados obtenidos se pueden observar en la figura 5.
Aparentemente, esta sustitución no produciría distorsiones estéricas importantes, dado que el grupo fenilo de la Phe50 está orientado hacia en el interior de la proteína y además se localiza en un “loop”. Además, aunque a la hora de superponer las proteínas vemos diferencias en estructurales en una lámina β, no se aprecian en la región donde se encuentra la Phe/Tyr50, por lo que podría ser un artefacto de la representación de ambas proteínas.
No obstante, cómo se puede apreciar en la figura 6, el nuevo grupo OH se encuentra a una distancia de tan solo 2,3 Å del nitrógeno de la cadena principal de la Gly35, de modo que podría establecerse un enlace de hidrógeno fuerte, según el autor George A. Jeffrey [1] entre ambos residuos. Éste autor clasifica los enlaces de H según las distancias donador-aceptor: las que van de 2,2 a 2,5 Å los clasifica como “fuertes, predominantemente covalentes”, los de 2,5 a 3,2 Å como “moderados, principalmente electrostáticos” y los de 3,2 a 4,0 Å como “débiles, electrostáticos”.
Como consecuencia, aunque no aparezcan distorsiones estéricas significativas, este cambio sí podría afectar la estabilidad de la proteína de forma positiva, estando muy cerca del extremo amino terminal de la proteína. Esto no dejan de ser suposiciones y habría que probarlo experimentalmente.
