PETasa | Misitio

1. Documentar y revisar bibliográficamente la proteína asignada. Se trata de una tarea a desarrollar a todo lo largo del Curso. Su objetivo es reunir los trabajos científicos clave y los datos necesarios para conocer lo mejor posible la proteína asignada a cada alumno haciendo particular énfasis en los aspectos estructurales y funcionales.

Antes de revisar la bibliografía existente sobre la proteína asignada es necesario poner en énfasis uno de los grandes problemas que acucian a nuestra sociedad actualmente: la masiva cantidad de plástico presente en nuestro medio ambiente que causa la muerte de la fauna y flora en todo el mundo. Unos de los polímeros plásticos más usados en la producción de botellas y textiles, debido a su transparencia, maleabilidad y resistencia a los procesos de degradación natural, es el tereftalato de polietileno (PET), que está compuesto de ácido tereftálico (TPA) y etilenglicol (EG) unidos mediante un enlace éster (Figura 1). La producción anual de PET se estima en más de 50 millones de toneladas y grandes cantidades de este plástico se acumulan, como hemos dicho, en forma desechos en los océanos y han causado una grave carga ambiental [1].

Algunos microorganismo, como bacterias y hongos, pueden degradar los plásticos con enlaces éster a través de la hidrólisis enzimática cuando colonizan las superficies de los materiales. El grado de biodegradabilidad de los plásticos depende de sus propiedades químicas y físicas, siendo el PET uno de los plásticos recalcitrantes a tal biodegradación [2].

Así, el uso de enzimas obtenidas y modificadas a partir de esos microorganismos para descomponer el PET en sus componentes básicos es una estrategia ecológica para reducir los desechos plásticos y recuperar los materiales de partida a base de petróleo, TPA y EG, cerrando el ciclo de producción y reciclaje de PET [2].

Hasta el momento se ha demostrado que varias hidrolasas bacterianas, como las cutinasas, las lipasas, las carboxilesterasas y las esterasas, degradan el PET, aunque en diferentes grados. Entre las enzimas degradantes de PET identificadas, las que presentan una actividad “mayor” para la degradación del PET son las hidrolasas TfH BTA-1 y TfH BTA-2 de Thermobifida fusca DSM43793, las cutinasas TfCut1 y TfCut2 de T. fusca KW3 y la lipasa B de Candida antarctica. Sin embargo, la capacidad de degradación aún son demasiado bajas para aplicaciones industriales [2]. Para mejorar la actividad enzimática la estrategia más utilizada es la mutagénesis dirigida del sitio activo aunque la introducción de iones Ca2+ o Mg2+ y la adición de puentes disulfuro pueden mejorar la estabilidad térmica de las esteraras y aumentar su actividad. A pesar de estos intentos, la actividad de degradación de PET sigue siendo baja [2,3].

Recientemente se aisló una nueva especie bacteriana, Ideonella sakaiensis, que puede utilizar el PET como fuente de carbono, gracias a que secreta una hidrolasa, similar a las cutinasas ya conocidas, capaz de degradarlo a bis (2-hidroxietil) TPA (BHET), mono (2-hidroxietil) TPA (MHET), TPA y EG (figura 2) [1].

Esta hidrolasa de I. sakaiensis, denominada PETasa (IsPETasa) (EC 3.1.1.101), puede degradar el PET a temperatura ambiente (aprox. 30 °C) y a pH neutro. Tiene una actividad 5,5 a 120 veces mayor y especificidad relativamente mayor que otras enzimas que degradan el PET, como las cutinasas y las lipasas [1,2].

Esta será la proteína que analizaremos desde un punto de vista estructural y funcional en esta asignatura. Para entender su funcionamiento y cómo cataliza la degradación del PET, primero se hará una revisión de la estructura de esta enzima descubierta recientemente.

1. Estructura general de IsPETasa.

La IsPETasa (PDB: 5xjh.pdb) es una enzima con estructura terciaria que pertenece a la superfamilia de hidrolasas α / β, donde la lámina β central está formada por nueve cadenas β mixtas (β1-β9) y está rodeada por siete hélices α (α1-α7) (Figura 3 y 4). Además esta hidrolasa es activa como monómero por lo que solo presenta una subunidad [2].

Para identificar el centro activo de la enzima se emplearon técnicas de la cocristalización de la misma con sustratos y un análisis bioinformático comparativo con otras enzimas que llevan a cabo una hidrólisis de compuestos similares al PET. Así debido a la alta identidad de secuencia (hasta 47%) a otros cutinasas homólogas, la ubicación de la tríada catalítica de esta enzima, que comprende a la Ser160-His237-Asp206, puede ser fácilmente identificados (figura 5) [1,2].

Hay que destacar que según el fichero PDB utilizado para el estudio de esta enzima, la numeración de los residuos varía debido a que, al ser expresadas mediante vectores de expresión en otros organismo para obtener suficiente cantidad para la cristalización, pueden quedarse residuos en la proteína y que éstos no se hayan eliminado de la numeración el PDB, aunque de la estructura si lo estén. Un ejemplo se da entre el PDB 5xjh.pdb y 5XG0, donde en la primera la serena del centro activo está marcado como Ser160 y en el segundo Ser131.

Existe además un surco superficial donde el sustrato se acomodará en el centro activo y la Ser160 parece estar en el fondo (Figura 6). Curiosamente, el sitio activo de la PETasa parece ser más ancho que len as otras cutinasas. El espacio más amplio de unión al sustrato puede ser uno de los factores que explican por qué la PETasa podría acomodar un sustrato más voluminoso como el PET. Sin embargo, los residuos que comprenden la bolsa de unión al sustrato se conservan o se semiconservan en PETasa y otras enzimas homólogas. En este contexto, otros factores alternativos distintos del tipo de aminoácido pueden contribuir a alterar el bolsillo de unión al sustrato. Por ejemplo, Trp159 se conserva estrictamente en todas las enzimas homólogas pero exhibe más de una conformación en PETasa. Este fenómeno, denominado "oscilación de Trp159", juega un papel importante en la reacción catalítica que se explicará más adelante [1,4,5].

Otra característica estructural que podemos descartar cercana al centro activo, que posteriormente describiremos con detalle, es la presencia de dos apuntes disulfuros intramoleculares (DS1 y DS2), mientras que las otras enzimas homólogas tienen solo una. El DS2 es el que está estrictamente conservado (C273-C289) y conecta la hélice C-terminal y el último bucle, mientras que el DS1 específico de la PETasa (C203-C239) une dos bucles que albergan el ácido y base que llevaran a cabo la catálisis, haciendo que este sea estable y sea más amplio de igual forma (figura 6). [4] Ademas representamos la estructura en base a su factor b o de temperatura y podemos ver que las regiones de los puentes disulfuro tienen un movimiento más restringido que sus alrededores

2. Sitio activo de Is PETase

Como dijimos la IsPETasa degrada el PET en monómeros como el BHET, MHET y TPA. A la vez esta enzima es capaz de hidrolizar el BHET a MHET. Estos sustratos parecen unirse al centro activo mediante un acoplamiento covalente, donde los cuatro monómero que conforma el PET se unirían a la región del centro activo [2].

En el sitio activo de IsPETase, que se encuentra en la superficie de la misma, encontramos tres residuos Ser160, His237 y Asp206 (figura 5) que forman una tríada catalítica. La Ser160 funciona como un nucleófilo covalente al átomo de carbono carbonilo en el enlace éster que va a ser hidrolizado, como en otras carboxilesterasas. El oxianión del intermedio tetraédrico que se forma con el sustrato se estabiliza por los átomos de nitrógeno de la Tyr87 y Met160, que se encuentran a una distancia determinada del sustrato de 2.90 y 2.83 Å, respectivamente [2].

Debido a que no dispongo del modelo proteico de la PETasa con el sustrato, se va a utilizar una figura 7 obtenida de [2].

La superficie de la hendidura de unión al sustrato es principalmente hidrófoba y la longitud de la hendidura es de ~ 40 Å, que es el tamaño aproximado de estos cuatro monómeros (imagen 7) [2].

Utilizando como sustrato el tetrámero 2-HE (MHET)4, el sitio donde se aloja el enlace éster que va a ser cortado se puede dividir en dos subsitios, subsitio I y subsitio II, donde se unen uno y tres restos MHET, respectivamente. Para la unión del primer resto MHET en el subsitio I, el anillo de benceno se coloca en una zona entre los dos residuos aromáticos de Tyr87 y Trp185. Las interacciones π - π entre Trp185 y el anillo de benceno del primer resto MHET con una distancia de aproximadamente 3.6 Å parecen ser un contribuyente principal a la estabilización del ligando. También se predice que Met161 e Ile208 ayudan a la unión del primer MHET al proporcionar una superficie hidrófoba en la parte inferior y lateral del subsitio I, respectivamente, aunque no son tan cruciales como los residuos Tyr87 y Trp185 para la estabilización del ligando. El subsitio II tiende a formar una hendidura más larga y menos profunda que el subsitio I ya que alberga tres restos MHET. En lo que refiere a la unión del sustrato el subsitio II se divide a su vez en tres partes, el subsitio IIa, IIb y IIc. El subsitio II está compuesto de residuos que incluyen residuos tales como Thr88, Ala89, Trp159, Ile232, Asn233, Ser236, Ser238, Asn241, Asn244, Ser245, Asn246 y Arg280 [2], donde para la constitución del sitio son cruciales principalmente dos de ellos Trp159 y Asn241, como ya avanzamos (figura 8) [1,2].

Aunque la interacción entre el subsitio II y los tres restos MHET parece estar mediada principalmente por interacciones hidrófobas, los átomos de oxígeno en el cuarto resto MHET también forman interacciones polares con una cadena principal de Ser236 y una cadena lateral de Asn246 en el subsitio IIc. La Arg280 se ubica al final del subsitio IIc y el residuo que parece impedir la unión estable del sustrato de PET más allá del cuarto resto debido a su carga positiva y que su estructura sobresale ligeramente [2].

Todos los residuos que son importantes para llevar a acabo la unión del ligando a la enzima y que ésta lleve a cabo la catálisis se confirmaron con experimentos de mutagénesis sitio específicas, donde suprimiéndolos por Ala se suprimía o disminuía la actividad de la enzima.

3. PET mecanismo de degradación por Is PETase

Sobre la base de las observaciones estructurales y los estudios bioquímicos llevados acabo con esta enzima se ha propuesto el siguiente proceso de degradación de PET.

Para comenzar la degradación de la PET, la PETasa secretada por la bacteria primero se uniría a la superficie de la PET utilizando su superficie hidrófoba plana que tiene una hendidura de unión al sustrato. El proceso de degradación de PET se puede dividir en dos pasos, paso de generación de la escisión del enlace y paso de hidrólisis terminal.

En la etapa de generación del corte, cuatro restos MHET están unidos a cada subsitio (un resto MHET al subsitio I y tres restos MHET al subsitio II) y el enlace éster escindible parece posicionarse entre el subsitio I y II cerca del residuo catalítico de Ser160. Luego, la escisión de un enlace éster provoca la formación de un corte entre los residuos del PET, lo que da como resultado la generación de dos cadenas PET con diferentes terminales: terminal TPA liberada desde el subsitio I y terminal HE liberada desde el subsitio II.

En la 2º etapa, dos cadenas de PET que tienen los extremos HE y TPA se digieren en monómeros MHET de maneras algo diferentes.

Para la hidrólisis de PET con HE-terminal (HE-PET), el MHET terminal y los siguientes tres restos MHET se unen al subsitio I y al subsitio II, respectivamente, y la rotura del enlace éster da como resultado la producción de un monómero de MHET y (HE-PET )(n−1) . La digestión de éste ultimo se espera que se produzca de manera similar a la del primer proceso de escisión.

La hidrólisis de PET con TPA al final ocurre a través del posicionamiento de éste y los siguientes tres restos MHET en el subsitio I y el subsitio II, respectivamente. La escisión del enlace éster parece producir una molécula de TPA y (HE-PET )(n−1), y este (HE-PET )(n−1) sufre una hidrólisis posterior como se observa en el proceso de degradación de HE-PET.

Alternativamente, HE-PET y TPA-PET también puede ser hidrolizado a través de la unión de las cadenas de polímero PET y la enzima en la dirección inversa, aunque este tipo de catálisis podría ser menos eficiente que la digestión anterior. En este caso, uno o dos restos MHET, en lugar de tres restos MHET, pueden unirse al subsitio II. Estas uniones pueden producir una variedad de monómeros y dímeros de PET tales como 2-HE(MHET)2, (MHET)2, MHET and BHET, que pueden ser finalmente digeridos a MHET, TPA y EG.

De esta forma, las hidrólisis continuas de HE-PET y TPA-PET proceden de manera combinatoria, como se describió anteriormente, dando como resultado la acumulación de cuatro moléculas, incluyendo MHET, TPA, BHET y EG. BHET se puede degradar aún más en MHET y EG, y finalmente, tres moléculas, MHET, TPA y EG, se acumulan debido a la degradación del PET. Además, vale la pena señalar que la degradación de la película de PET por IsPETasa acumula una cantidad significativa de TPA, aunque IsPETase no puede hidrolizar MHET a TPA y EG [2].

Esta forma de hidrólisis se describe en la siguiente imagen (figura 9).

Siendo más específicos en el mecanismo de catálisis e hidrólisis (figura 10), veremos como éste ocurre. Primero hay que resaltar que el Trp159 [2] (Trp156 según otras publicaciones [1]) debe estar en la conformación B (azul) para permitir la unión del ligando, lo que sugiere que en otras enzimas que hidrolizan el PET, el Trp equivalente en una conformación C (rosa) no favorece la unión del sustrato. En este contexto, el S185, que permite el movimiento de W159, es una característica importante de la PETasa [4].

En la IsPETasa el PET se une al bolsillo principalmente a través de interacciones hidrófobas, con el grupo carbonilo posicionado en el centro catalítico con su átomo de O frente al orificio de oxianión. El Trp159 debe estar en la conformación B para proporcionar una fuerza de apilamiento en T al resto de TPA de PET. A continuación, tiene lugar una reacción hidrolítica canónica, con formación intermedia de un acil-enzima y un segundo ataque nucleófilo por la molécula de agua para romper el enlace éster. El grupo de ácido benzoico restante que forma una superficie plana más amplia es propenso a una interacción de apilado π más fuerte con Trp159. De este modo, el producto se gira y se retira, y finalmente se libera del centro activo [1].

Como conclusión, si en un futuro somos capaces de mejorar enzimas naturales para que degraden todo tipo de plástico, el planeta puede tener una posibilidad de no verse cubierto de estos materiales. Llegaríamos a la situación ideal de un reciclaje/degradado del 100%.

Bibliografía

1. Chen, C. C., Han, X., Ko, T. P., Liu, W. & Guo, R. T. Structural studies reveal the molecular mechanism of PETase. FEBS J. 285, 3717–3723 (2018).

2. Joo, S. et al. Structural insight into molecular mechanism of poly(ethylene terephthalate) degradation. Nat. Commun. 9, (2018).

3. Kawai, F., Kawabata, T. & Oda, M. Current knowledge on enzymatic PET degradation and its possible application to waste stream management and other fields. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2019).

4. Han, X. et al. Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase. Nat. Commun. 8, (2017).

5. Austin, H. P. et al. Characterization and engineering of a plastic-degrading aromatic polyesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. 115, E4350–E4357 (2018)