Ingeniería de proteínas (2018-2019)
PETasa de Ideonella sakaiensis
7. Desarrollar una función biotools (que denominaremos writePDB) que permita reconstruir una línea de texto con el formato correcto de una línea ATOM de un PDB. Emplear esta función para escribir un programa que genere un fichero PDB, a partir de una estructura TPDB previamente importada, que contenga solamente los carbonos alfa de la proteína. Comprobar que el fichero *.pdb creado puede ser visualizado con RASMOL (u otro visor equivalente) y crear a partir de él una imagen GIF del esqueleto covalente de la proteína en modo spacefill , coloreada según sus factores de temperatura. Identificar, sobre esta imagen, los residuos más desordenados de la proteína y elaborar finalmente un breve informe sobre su localización en la estructura.
El objetivo de esta actividad es representar los carbonos α de una proteína utilizando en este caso el programa PyMOL en formato “spacefill” (spheres) y con la coloración de temperatura, basada en su factor de temperatura o factor b.
El programa realizado en Lázarus/Pascal, llamado actividad7.exe, utiliza algunas de las funciones comentadas de la librería BioTools. En primer lugar éste, carga un fichero en formato pdb y extrae toda la información de los carbonos α del mismo. Después haciendo uso de la función writelinePDB, descrita previamente, se crea un nuevo fichero .pdb con los carbonos α, el cual debemos de guardar. A continuación, es necesario cargar dicho fichero en el programa de visualización de proteínas PyMOL y representar la cadena de carbonos en modo “spacefill” (spheres) y con la coloración temperature (factor b), que colorea cada átomo dependiendo del factor de temperatura, tal y como aparece en el fichero .pdb.
La interfaz del programa se muestra en la figura 1.
Gracias a la función writelinePDB podemos, de manera automática, reescribir las lineas ATOM de un fichero .pdb a partir de nuestra estructura TproteinPDB de tal forma que en la siguiente imagen (figura 2) se compara el fichero 5xjh.pdb y CA5xjh.pdb, estando este ultimo creado con nuestra función.
Antes de continuar con la actividad es conveniente explicar qué significa el factor b o factor de temperatura.
Éste factor de temperatura o factor B se puede considerar como una medida de cuánto un átomo oscila o vibra alrededor de la posición especificada en el modelo de la proteína. De forma general, se espera que los átomos de los extremos de la cadena lateral muestren más libertad de movimiento que los átomos de la cadena principal, y este movimiento equivale a extender cada átomo sobre una pequeña región del espacio [1]. Este factor es importante darlo para cada átomo ya que es uno de los parámetros a tener en cuenta para determinar la calidad del modelo a partir de datos cristalográficos y se obtiene de estos mismos datos. La difracción de rayos X, utilizada para determinar la estructura proteica, se ve afectada por esta variación en la posición atómica, por lo que es realista asignar un factor de temperatura a cada átomo e incluir el factor entre los parámetros para optimizar durante el análisis estadístico y optimización por mínimos cuadrados
A partir de los factores de temperatura calculados, se puede tener una idea aproximada de qué átomos en la molécula tienen mayor libertad de movimiento y obtenemos información sobre la dinámica de nuestro modelo, que en gran medida se representa estático. Además, añadir los efectos de movimiento a nuestro modelo lo hace más realista y por lo tanto más probable que se ajuste a los datos con precisión [1].
Así, los valores de temperatura más altos aparecen en colores más cálidos (rojo), y los más bajos en colores más fríos (azul). La imágenes obtenida de la PETasa, girada cada una 180 grados con respecto la otra, a partir del fichero 5xjh.pdb se encuentra en la figura 3.
En la figura 3 vemos que hay zonas o residuos que presentan una mayor capacidad de movimiento que otros. De esta forma, hay una región superficial de la PETasa que muestra unos valores de temperatura moderadamente elevados (verde y azul claro) que podría deberse a que es la zona de interacción con el sustrato de la enzima, el PET. Esta zona es el subsitio I y el II, que engloba al centro activo de la enzima. También podemos destacar cómo el extremo carboxilo y amino terminal de la proteína presentan valores de factor b superiores debido a que no están sujetos a la interacciones hidrófobas y puentes disulfuros que mantienen la estructura de la proteína estable.
Así en la figura 4 se colorean exclusivamente los carbonos α de los residuos más representativos de los subsitios I (Tyr87 y Trp185, Met161 e Ile208) y II (Thr88, Ala89, Trp159, Ile232, Asn233, Ser236, Ser238, Asn241, Asn244, Ser245, Asn246 y Arg280) y los del centro activo (Ser160, Asp206 y His237). En este caso el centro activo es el que tiene más movilidad con respecto el resto de aminoácidos debido a que éste es necesario para llevar a cabo una hidrólisis eficiente.
Si cambiamos el modo de representación de los átomos y representamos la superficie de éstos, en la figura 5 vemos como se muestra muy claramente el bolsillo hidrofóbico (azul oscuro) muy estable en el fondo donde se une el PET y con mayor movimiento los residuos que permiten el ajuste de éste tanto al subsitio II como el propio ácido aspártico del centro activo.
Como conclusión, el movimiento inherente de las proteínas les permite llevar a cabo su función gracias a la interacción con otras moléculas, como los sustratos en caso de enzimas, y otras proteínas. Generalmente, la interacción entre una proteína y una molécula se produce por aquellas regiones en las que la flexibilidad es mayor, aunque hay veces, como es este caso, en el que el bolsillo que acopla al trímero de subPET es muy estable.
Bibliografía
[1] https://spdbv.vital-it.ch/TheMolecularLevel/ModQual/#Temperature%20factor%20(crystallogr